疟疾是一种严重威胁人类健康的传染性疾病。据WHO估计，2022年全球发病2.49亿例，死亡60.8万人，其中90%以上死于恶性疟。及时、有效的治疗是降低疟疾死亡率的关键。目前，青蒿素类药物是抗击疟疾的最后一道屏障，然而恶性疟原虫已对包括青蒿素类药物在内的几乎所有抗疟药产生了不同程度的耐药性，这为疟疾治疗带来巨大挑战。有研究表明K13螺旋桨蛋白（K13-propeller, K13）是恶性疟原虫抗青蒿素的分子标尺，K13基因的一些突变与青蒿素抗性相关。目前已有10个K13基因的点突变被确认为青蒿素耐药分子标记，但实际存在的突变远不止于此，现已发现的非同义突变有260多个。因此，明确这些基因突变与耐药性的关系至关重要，这将有助于监测恶性疟原虫的耐药性，并指导临床用药。在K13基因的众多突变中，1-3个天冬酰胺（Asparagine, N）的插入出现的频率高达86%，而且有逐年升高的趋势。我们在早期的研究中还发现，这种插入突变，与临床治疗中疟原虫的延迟清除存在关联。但病人来源的虫株，该插入突变常常伴随其他突变，所以，单独的天冬酰胺的插入与耐药性之间的关系尚不明确。
因此，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建了K13基因中仅包含天冬酰胺插入的恶性疟原虫株：在3D7虫株的K13基因第142位氨基酸后精准插入1-3天冬酰胺残基，构建出1N-3D7、2N-3D7和3N-3D3突变株，然后探讨了1-3个天冬酰胺的插入突变与抗药性之间的关系。研究结果表明：1）天冬酰胺的插入数量与寄生虫的环状体存活率（Ring-stage survival assay, RSA）呈正相关，插入的残基越多，在药物压力下，疟原虫的存活率越高。2）药物半数抑制浓度（IC50）检测结果显示，1N-3D7与2N-3D7对十种抗疟药物的敏感性相似，二者仅对萘酚喹产生抗性；但3N-3D7却对青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素、磷酸咯萘啶和萘酚喹这五种药物产生耐药性。3）监测3N-3D7在红内期的发育情况，一方面，3N-3D7通过延长对药物不敏感的环状体期和缩短对药物最敏感的滋养体期来应对青蒿素类药物的杀灭作用；另一方面，虽然其裂殖体期与对照虫株一致，但其成熟裂殖体所含裂殖子数量显著减少，这一改变可能是3N-3D7对磷酸咯萘啶和萘酚喹这两种主要作用于裂子体的药物产生抗性的原因。这些结果表明：在K13螺旋桨蛋白中，三个天冬酰胺的插入是恶性疟原虫对青蒿素类药物、磷酸咯萘啶和萘酚喹等多种药物的抗性分子标记。
本研究由昆明医科大学基础医学院杨照青教授团队完成，相关研究结果以“Three Asparagine insertions in the K13-propeller led to Plasmodium falciparum becoming resistant to multiple antimalarial drugs”为题，发表于中科院，医学二区期刊《International journal for parasitology: Drugs and drug resistance》（文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40466595/）。
研究工作受国家自然科学基金和云南省应用基础联合专项等项目支持。
