血管生成素1（Angiopoietin-1，ANG1）属于血管生成素家族，通常由周细胞（Pericyte）表达并经糖基化后分泌到细胞外，作用于血管内皮细胞Tie2受体而促进内皮细胞存活、迁移和管腔形成，进而参与血管新生、管腔重建和稳定的调控。近年研究显示，肿瘤细胞亦可表达并分泌ANG1，促进肿瘤血管新生，然而ANG1在肿瘤细胞内的功能和作用机制尚未清楚。最近昆明医科大学生物医学工程研究院陈策实研究员团队发现，ANG1在三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）中高表达，并通过非分泌形式激活羧肽酶A4（Carboxypeptidase A4，CPA4）基因的转录和表达，进而通过上调Cyclin D1促进癌细胞增殖。2023年5月9日，该团队在Acta Biochimica et Biophysica Sinica期刊在线发表题为“Angiopoietin-1 promotes triple-negative breast cancer cell proliferation by upregulating carboxypeptidase A4”的研究论文。
ANG1通过非分泌形式促进TNBC癌细胞增殖
研究人员在TNBC癌细胞中敲低ANG1的表达，并通过SRB和克隆形成实验发现敲低ANG1可显著抑制癌细胞增殖。当在TNBC癌细胞中过表达ANG1，则可显著促进癌细胞增殖，且该促进作用基于其非分泌形式（图1）。
图1. ANG1以非分泌形式促进TNBC癌细胞增殖
ANG1敲低诱导癌细胞发生G1期阻滞和凋亡
研究人员进一步通过流式检测细胞周期和细胞凋亡情况，发现ANG1的敲低可导致TNBC癌细胞发生G1期阻滞，并诱导癌细胞凋亡。同时Western blot实验显示ANG1敲低可显著下调G1期重要调控分子Cyclin D1的表达（图2）。
图2. ANG1敲低诱导TNBC癌细胞G1期阻滞和凋亡
ANG1参与CPA4转录调控
为了明确ANG1如何参与癌细胞增殖调控，研究人员通过进行RNA-seq发现，ANG1的敲低可显著下调CPA4基因的转录。在TCGA数据库乳腺癌临床样本中，CPA4与ANG1一样，在TNBC中显著高表达，且二者表达水平具有正相关趋势。研究人员通过Real-time PCR和Western blot实验，明确ANG1在TNBC癌细胞中通过激活CPA4基因转录而上调CPA4表达（图3）。
图3. ANG1在TNBC癌细胞中参与CPA4基因的转录调控
ANG1通过CPA4/Cyclin D1轴促进癌细胞增殖
研究人员通过在TNBC癌细胞中敲低CPA4的表达，发现该分子的敲低亦可下调Cyclin D1表达，并显著抑制癌细胞增殖。为明确ANG1是否通过CPA4/Cyclin D1轴影响癌细胞增殖，研究人员进一步在过表达ANG1的基础上敲低CPA4的表达。Western blot和SRB实验结果显示，ANG1过表达可上调TNBC癌细胞中CPA4和Cyclin D1的蛋白水平，并显著促进癌细胞增殖，而CPA4的敲低则能部分抵抗由ANG1过表达所致的CyclinD1上调和增殖促进作用（图4）。
图4. ANG1在TNBC癌细胞中通过CPA4/Cyclin D1轴促进细胞增殖
ANG1通过CPA4/CyclinD1轴促进TNBC肿瘤生长
为了明确ANG1是否通过CPA4/Cyclin D1轴影响TNBC肿瘤生长，研究人员利用ANG1稳定过表达的TNBC细胞，在雌性裸鼠第四对乳腺脂肪垫内建立乳腺癌移植瘤模型，实验结果显示ANG1过表达可显著促进TNBC移植瘤生长。通过进一步对移植瘤组织样本进行Western blot、免疫组织化学和Real-time PCR等实验，结果显示ANG1过表达能显著上调移植瘤内CPA4的转录水平，并增加CPA4、Cyclin D1和Ki67的蛋白水平（图5）。
图5. ANG1通过上调CPA4/Cyclin D1轴而促进TNBC移植瘤生长
结论
这项研究表明，ANG1在临床TNBC样本中高表达并提示不良预后，该蛋白分子通过非分泌形式激活TNBC癌细胞中CPA4基因的转录，进而通过上调CPA4/Cyclin D1轴，以促进癌细胞增殖和移植瘤生长。
